Javascript מושבת כעת בדפדפן שלך.כאשר javascript מושבת, חלק מהפונקציות של אתר זה לא יפעלו.
חוויאר פידלגו, * פייר-אנטואן דגלסנה, * רודריגו ארויו, * ליליאן ספולוודה, * יבגניה רנווה, המחלקה למדע פיליפ דפרז, קבוצת סקין טק פארמה, קסטלו ד'אמפוריס, קטלוניה, ספרד * לכותבים אלה יש כמה תובנות לגבי יצירה זו שווה רקע תרומה: חומצה היאלורונית (HA) היא פוליסכריד המופיע באופן טבעי המשמש בייצור חומרי מילוי עוריים למטרות אסתטיות.מכיוון שיש לו זמן מחצית חיים של מספר ימים ברקמות אנושיות, חומרי מילוי עוריים על בסיס HA עוברים שינוי כימי כדי להאריך את חייהם בגוף.השינוי הנפוץ ביותר בחומרי מילוי מסחריים המבוססים על HA הוא השימוש ב-1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) כחומר צולב לצלב את שרשראות ה-HA.BDDE שיורי או לא הגיב נחשב לא רעיל בפחות מ-2 חלקים למיליון (ppm);לכן, יש לכמת את שאריות ה-BDDE בחומר המילוי העורי הסופי כדי להבטיח את בטיחות המטופל.חומרים ושיטות: מחקר זה מתאר זיהוי ואפיון של תוצר לוואי של תגובת ההצלבה בין BDDE ו-HA בתנאים אלקליים על ידי שילוב של כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה (LC-MS).תוצאות: לאחר ניתוחים שונים, נמצא כי התנאים האלקליים והטמפרטורה הגבוהה המשמשים לחיטוי ההידרוג'ל HA-BDDE קידמו את היווצרותו של תוצר הלוואי החדש הזה, התרכובת "דמוי פרופילן גליקול".ניתוח LC-MS אישר שלתוצר הלוואי יש אותה מסה מונואיזוטופית כמו ל-BDDE, זמן שמירה שונה (tR) ומצב ספיגת UV שונה (λ=200 ננומטר).בניגוד ל-BDDE, נצפה בניתוח LC-MS כי באותם תנאי מדידה, לתוצר הלוואי הזה יש קצב זיהוי גבוה יותר ב-200 ננומטר.מסקנה: תוצאות אלו מצביעות על כך שאין אפוקסיד במבנה של תרכובת חדשה זו.הדיון פתוח להערכת הסיכון של תוצר לוואי חדש זה שנמצא בייצור הידרוג'ל HA-BDDE (חומר מילוי עורי HA) למטרות מסחריות.מילות מפתח: חומצה היאלורונית, מילוי עורי HA, חומצה היאלורונית צולבת, BDDE, ניתוח LC-MS, תוצר לוואי של BDDE.
חומרי מילוי המבוססים על חומצה היאלורונית (HA) הם חומרי המילוי העוריים הנפוצים והפופולריים ביותר המשמשים למטרות קוסמטיות.1 מילוי עורי זה הוא הידרוג'ל, המורכב בדרך כלל מ->95% מים ו-0.5-3% HA, מה שמקנה להם מבנה דמוי ג'ל.2 HA הוא פוליסכריד והמרכיב העיקרי של המטריצה החוץ-תאית של בעלי חוליות.אחד המרכיבים.הוא מורכב מ-(1,4)-חומצה גלוקורונית-β (1,3)-N-אצטיל גלוקוזאמין (GlcNAc) יחידות דו-סוכרים חוזרות המחוברות בקשרים גליקוזידיים.דפוס דו-סוכר זה זהה בכל האורגניזמים.בהשוואה לחומרי מילוי מסוימים המבוססים על חלבון (כגון קולגן), תכונה זו הופכת את HA למולקולה בעלת תאימות ביולוגית ביותר.חומרי מילוי אלו יכולים להפגין סגוליות של רצף חומצות אמינו שעשויות להיות מזוהות על ידי מערכת החיסון של המטופל.
כאשר משתמשים בו כחומר מילוי עורי, המגבלה העיקרית של HA היא התחלופה המהירה שלו בתוך הרקמות עקב נוכחות של משפחה ספציפית של אנזימים הנקראים היאלורונידאזות.עד כה, תוארו מספר שינויים כימיים במבנה ה-HA כדי להגדיל את זמן מחצית החיים של HA ברקמות.3 רוב השינויים הללו מנסים להפחית את הגישה של היאלורונידאז לפולימרים פוליסכרידים על ידי חיבור שרשראות HA.לכן, עקב יצירת גשרים והקשרים הקוולנטיים הבין-מולקולריים בין מבנה ה-HA לחומר המצולב, ההידרוג'ל HA המצולב מייצר יותר תוצרי פירוק אנטי-אנזים מאשר ה-HA הטבעי.4-6
עד כה, חומרי ההצלבה הכימיים המשמשים לייצור HA מוצלבת כוללים מתאקרילאמיד, 7 הידראזיד, 8 קרבודיאימיד, 9 דיוויניל סולפון, 1,4-בוטנדיול דיגליצידיל אתר (BDDE) ופולי(אתילן גליקול) דיגליצידיל אתר.10,11 BDDE הוא כיום חומר ההצלבה הנפוץ ביותר בשימוש.למרות שסוגים אלה של הידרוג'לים הוכחו כבטוחים במשך עשרות שנים, חומרי ההצלבה המשמשים הם ריאגנטים תגובתיים שעלולים להיות ציטוטוקסיים, ובמקרים מסוימים, מוטגנים.12 לכן, התוכן השיורי שלהם בהידרוג'ל הסופי חייב להיות גבוה.BDDE נחשב בטוח כאשר הריכוז השיורי נמוך מ-2 חלקים למיליון (ppm).4
קיימות מספר שיטות לזיהוי ריכוז BDDE בעל שאריות נמוכות, דרגת קישור צולב ומיקום החלפה בהידרוג'לים של HA, כגון כרומטוגרפיית גז, כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (MS), שיטות מדידת פלואורסצנציה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), ו כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים (HPLC) בשילוב מערך דיודות.13-17 מחקר זה מתאר זיהוי ואפיון של תוצר לוואי בהידרוג'ל HA המוצלב הסופי שנוצר על ידי התגובה של BDDE ו-HA בתנאים אלקליים.HPLC וכרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (ניתוח LC-MS).מכיוון שהרעילות של תוצר הלוואי הזה של BDDE אינה ידועה, אנו ממליצים לקבוע את כימת השאריות שלו באופן דומה לשיטה המבוצעת בדרך כלל על BDDE במוצר הסופי.
למלח הנתרן המתקבל של HA (Shiseido Co., Ltd., טוקיו, יפן) יש משקל מולקולרי של ~1,368,000 Da (שיטת לורן) 18 וצמיגות פנימית של 2.20 m3/kg.עבור תגובת ההצלבה, BDDE (≥95%) נרכש מ-Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, ארה"ב).מי מלח מבוצר עם פוספט עם pH 7.4 נרכש מחברת Sigma-Aldrich.כל הממיסים, האצטוניטריל והמים ששימשו בניתוח LC-MS נרכשו באיכות HPLC.חומצה פורמית (98%) נרכשת כדרגת מגיב.
כל הניסויים בוצעו על מערכת UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, ארה"ב) וחוברו לספקטרומטר מסה משולש quadrupole API 3000 מצויד במקור יינון אלקטרוספריי (AB SCIEX, Framingham, MA, ארה"ב).
הסינתזה של הידרוג'לים HA מוצלבים החלה על ידי הוספת 198 מ"ג של BDDE לתמיסת 10% (w/w) נתרן היאלורונט (NaHA) בנוכחות 1% אלקלי (נתרן הידרוקסיד, NaOH).ריכוז ה-BDDE הסופי בתערובת התגובה היה 9.9 מ"ג/מ"ל (0.049 מ"מ).לאחר מכן, תערובת התגובה עורבבה ביסודיות והומוגגנה והותרה להתקדם ב-45 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.19 ה-pH של התגובה נשמר על ~12.
לאחר מכן, תערובת התגובה נשטפה במים, והידרוג'ל HA-BDDE הסופי סונן ומדולל במאגר PBS כדי להשיג ריכוז HA של 10 עד 25 מ"ג/מ"ל, ו-pH סופי של 7.4.על מנת לעקר את ההידרוג'לים HA המצולבים המיוצרים, כל ההידרוג'לים הללו עוברים חיטוי (120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות).הידרוג'ל BDDE-HA המטוהר מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד לניתוח.
כדי לנתח את ה-BDDE הקיים במוצר HA המוצלב, דגימה של 240 מ"ג נשקללה והוכנסה לחור המרכזי (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, ארה"ב; נפח 0.5 מ"ל) ועברה צנטריפוגה ב-10,000 סל"ד בטמפרטורת החדר. 10 דקות.סה"כ 20 μL של נוזל נמשך נאספו ונותחו.
על מנת לנתח את תקן BDDE (Sigma-Aldrich Co) בתנאים בסיסיים (1%, 0.1% ו-0.01% NaOH), אם מתקיימים התנאים הבאים, דגימת הנוזל היא 1:10, 1:100, או עד 1:1,000,000 במידת הצורך, השתמש במים מפושטים של MilliQ לצורך ניתוח.
עבור חומרי המוצא המשמשים בתגובת ההצלבה (HA 2%, H2O, 1% NaOH, ו-0.049 mM BDDE), 1 מ"ל מכל דגימה שהוכנה מחומרים אלה נותחו באמצעות אותם תנאי ניתוח.
כדי לקבוע את הספציפיות של הפסגות המופיעות במפת היונים, נוספו 10 μL של תמיסה סטנדרטית של 100 ppb BDDE (Sigma-Aldrich Co) לדגימת 20 μL.במקרה זה, הריכוז הסופי של התקן בכל דגימה הוא 37 ppb.
ראשית, הכינו תמיסת מניות BDDE בריכוז של 11,000 מ"ג/ליטר (11,000 עמודים לדקה) על ידי דילול 10 μL של BDDE סטנדרטי (Sigma-Aldrich Co) עם 990 μL מים MilliQ (צפיפות 1.1 גרם/מ"ל).השתמש בתמיסה זו כדי להכין תמיסת BDDE של 110 מיקרוגרם/ליטר (110 ppb) כדילול סטנדרטי ביניים.לאחר מכן, השתמש במדלל הסטנדרטי של BDDE (110 ppb) כדי להכין את העקומה הסטנדרטית על ידי דילול חומר הביניים מספר פעמים כדי להשיג את הריכוז הרצוי של 75, 50, 25, 10 ו-1 ppb.כפי שמוצג באיור 1, נמצא כי לעקומת התקן BDDE מ-1.1 עד 110 ppb יש ליניאריות טובה (R2>0.99).העקומה הסטנדרטית חזרה על עצמה בארבעה ניסויים עצמאיים.
איור 1 עקומת כיול סטנדרטית של BDDE המתקבלת על ידי ניתוח LC-MS, שבה נצפה מתאם טוב (R2>0.99).
ראשי תיבות: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה.
על מנת לזהות ולכמת את תקני ה-BDDE הקיימים בתקני HA המצולבים ותקני BDDE בתמיסת הבסיס, נעשה שימוש בניתוח LC-MS.
ההפרדה הכרומטוגרפית הושגה על עמודת LUNA 2.5 מיקרומטר C18(2)-HST (50×2.0 מ"מ; Phenomenex, Torrance, CA, ארה"ב) ונשמרה בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) במהלך הניתוח.הפאזה הניידת מורכבת מאצטוניטריל (ממס A) ומים (ממס B) המכילים 0.1% חומצה פורמית.השלב הנייד נפלט על ידי פליטת שיפוע.השיפוע הוא כדלקמן: 0 דקות, 2% A;דקה אחת, 2% A;6 דקות, 98% A;7 דקות, 98% A;7.1 דקות, 2% A;10 דקות, 2% A. זמן הריצה הוא 10 דקות ונפח ההזרקה הוא 20 μL.זמן השמירה של BDDE הוא כ-3.48 דקות (נע בין 3.43 ל-4.14 דקות על סמך ניסויים).השלב הנייד נשאב בקצב זרימה של 0.25 מ"ל/דקה לניתוח LC-MS.
לניתוח וכימות BDDE על ידי MS, מערכת ה-UPLC (Waters) משולבת עם ספקטרומטר מסה משולש quadrupole API 3000 (AB SCIEX) המצויד במקור יינון אלקטרוספריי, והניתוח מבוצע במצב יונים חיוביים (ESI+).
על פי ניתוח שברי היונים שבוצעו על BDDE, המקטע בעל העוצמה הגבוהה ביותר נקבע כשבר המקביל ל-129.1 Da (איור 6).לכן, במצב ניטור רב-יונים (MIM) לכימות, המרת המסה (יחס מסה למטען [m/z]) של BDDE היא 203.3/129.1 Da.הוא גם משתמש במצב סריקה מלאה (FS) ובמצב סריקת יונים של מוצרים (PIS) לניתוח LC-MS.
על מנת לאמת את הספציפיות של השיטה, נותחה דגימה ריקה (שלב נייד ראשוני).לא זוהה אות בדגימה הריקה עם המרה מסה של 203.3/129.1 Da.לגבי יכולת החזרה של הניסוי, נותחו 10 זריקות סטנדרטיות של 55 ppb (באמצע עקומת הכיול), והביאו לסטיית תקן שיורית (RSD) <5% (נתונים לא מוצגים).
תכולת ה-BDDE השיורית הוכמתה בשמונה הידרוג'לים מסוג BDDE מוצלבים בחיטוי שונים, התואמים לארבעה ניסויים עצמאיים.כמתואר בסעיף "חומרים ושיטות", הכימות מוערך לפי הערך הממוצע של עקומת הרגרסיה של דילול תקן BDDE, התואם לשיא הייחודי שזוהה במעבר המסה של BDDE של 203.3/129.1 Da, עם שימור. זמן של 3.43 עד 4.14 דקות לא המתנה.איור 2 מציג כרומטוגרמה לדוגמה של תקן הייחוס BDDE של 10 ppb.טבלה 1 מסכמת את תכולת ה-BDDE השיורית של שמונה הידרוג'לים שונים.טווח הערכים הוא 1 עד 2.46 ppb.לכן, ריכוז ה-BDDE השיורי בדגימה מקובל לשימוש אנושי (<2 ppm).
איור 2 איור 2 כרומטוגרמת יון של תקן התייחסות BDDE 10 ppb (Sigma-Aldrich Co), מעבר MS (m/z) שהושג על ידי ניתוח LC-MS של 203.30/129.10 Da (במצב MRM חיובי).
ראשי תיבות: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה;MRM, ניטור תגובה מרובה;MS, מסה;m/z, יחס מסה למטען.
הערה: דגימות 1-8 הן הידרוג'לים מסוג BDDE מוצלבים בחיטוי.כמו כן, מדווחים כמות השיורית של BDDE בהידרוג'ל ושיא זמן השמירה של BDDE.לבסוף, מדווחים גם על קיומם של פסגות חדשות עם זמני שמירה שונים.
ראשי תיבות: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, חומצה היאלורונית;MRM, ניטור תגובה מרובה;tR, זמן שמירה;LC-MS, כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה;RRT, זמן שמירה יחסי.
באופן מפתיע, הניתוח של כרומטוגרמת היונים LC-MS הראה כי בהתבסס על כל דגימות ההידרוג'ל HA המוצלבות באוטוקלאב שניתחו, היה שיא נוסף בזמן השמירה הקצר יותר של 2.73 עד 3.29 דקות.לדוגמה, איור 3 מציג את כרומטוגרמת היונים של דגימת HA מוצלבת, כאשר שיא נוסף מופיע בזמן שמירה שונה של כ-2.71 דקות.זמן השמירה היחסי שנצפה (RRT) בין השיא החדש שנצפה לשיא מ-BDDE נמצא 0.79 (טבלה 1).מכיוון שאנו יודעים שהשיא שנצפה לאחרונה נשמר פחות בעמודת C18 המשמשת בניתוח LC-MS, השיא החדש עשוי להתאים לתרכובת קוטבית יותר מ-BDDE.
איור 3 איור 3 כרומטוגרמת יון של מדגם הידרוג'ל HA צלב שהושג על ידי LC-MS (המרה מסה MRM 203.3/129.0 Da).
ראשי תיבות: HA, חומצה היאלורונית;LC-MS, כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה;MRM, ניטור תגובה מרובה;RRT, זמן שמירה יחסי;tR, זמן שמירה.
על מנת לשלול את האפשרות שהפסגות החדשות שנצפו עשויות להיות מזהמים המצויים במקור בחומרי הגלם בהם נעשה שימוש, נותחו גם חומרי גלם אלו באמצעות אותה שיטת ניתוח LC-MS.חומרי המוצא שנותחו כוללים מים, 2% NaHA במים, 1% NaOH במים ו-BDDE באותו ריכוז המשמש בתגובת הצלבה.כרומטוגרמת היונים של חומר המוצא המשמש לא הראתה שום תרכובת או שיא, וזמן השמירה שלו מתאים לשיא החדש שנצפה.עובדה זו מבטלת את הרעיון שלא רק חומר המוצא עשוי להכיל תרכובות או חומרים שעלולים להפריע להליך הניתוח, אלא שאין סימן לזיהום צולב אפשרי עם מוצרי מעבדה אחרים.ערכי הריכוז שהושגו לאחר ניתוח LC-MS של BDDE ופסגות חדשות מוצגים בטבלה 2 (דגימות 1-4) ובכרומטוגרמת היונים באיור 4.
הערה: דגימות 1-4 תואמות את חומרי הגלם המשמשים לייצור הידרוג'לים HA בעלי BDDE צולבים באוטוקלאב.דגימות אלו לא עברו חיטוי.
ראשי תיבות: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, חומצה היאלורונית;LC-MS, כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה;MRM, ניטור תגובה מרובה.
איור 4 מתאים לכרומטוגרמה LC-MS של דגימה של חומר הגלם המשמש בתגובת ההצלבה של HA ו-BDDE.
הערה: כל אלה נמדדים באותו ריכוז ויחס המשמשים לביצוע תגובת ההצלבה.המספרים של חומרי הגלם שנותחו על ידי הכרומטוגרמה תואמים: (1) מים, (2) תמיסה מימית HA 2%, (3) תמיסה מימית NaOH 1%.ניתוח LC-MS מבוצע להמרה מסה של 203.30/129.10 Da (במצב MRM חיובי).
ראשי תיבות: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, חומצה היאלורונית;LC-MS, כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה;MRM, ניטור תגובה מרובה.
נחקרו התנאים שהובילו להיווצרות פסגות חדשות.על מנת לחקור כיצד תנאי התגובה המשמשים לייצור ההידרוג'ל HA המצולבת משפיעים על תגובתיותו של חומר ההצלבה BDDE, מה שמוביל להיווצרות פסגות חדשות (תוצרי לוואי אפשריים), בוצעו מדידות שונות.בקביעות אלה, למדנו וניתחנו את מצלב ה-BDDE הסופי, שטופל בריכוזים שונים של NaOH (0%, 1%, 0.1% ו-0.01%) במדיום מימי, ואחריו או בלי חיטוי.הליך החיידקים לדמות אותם תנאים זהה לשיטה המשמשת לייצור הידרוג'ל HA המצולב.כמתואר בסעיף "חומרים ושיטות", המעבר ההמוני של המדגם נותח על ידי LC-MS ל-203.30/129.10 Da.ה-BDDE וריכוז השיא החדש מחושבים, והתוצאות מוצגות בטבלה 3. לא זוהו שיאים חדשים בדגימות שלא עברו חיטוי, ללא קשר להימצאות NaOH בתמיסה (דגימות 1-4, טבלה 3).עבור דגימות חיטוי, פסגות חדשות מתגלות רק בנוכחות NaOH בתמיסה, ונראה כי היווצרות השיא תלויה בריכוז ה-NaOH בתמיסה (דגימות 5-8, טבלה 3) (RRT = 0.79).איור 5 מציג דוגמה של כרומטוגרמת יונים, המציגה שתי דגימות בחיטוי בנוכחות או היעדר NAOH.
ראשי תיבות: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה;MRM, ניטור תגובה מרובה.
הערה: הכרומטוגרמה העליונה: הדגימה טופלה בתמיסה מימית של 0.1% NaOH ונעשתה באוטוקלאב (120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות).כרומטוגרמה תחתונה: הדגימה לא טופלה ב-NaOH, אלא בוצעה באוטוקלאב באותם תנאים.המרה המסה של 203.30/129.10 Da (במצב MRM חיובי) נותחה על ידי LC-MS.
ראשי תיבות: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה;MRM, ניטור תגובה מרובה.
בכל הדגימות שעברו אוטוקלאב, עם או בלי NaOH, ריכוז ה-BDDE הופחת מאוד (עד פי 16.6) (דגימות 5-8, טבלה 2).הירידה בריכוז ה-BDDE עשויה לנבוע מכך שבטמפרטורות גבוהות, מים יכולים לפעול כבסיס (נוקלאופיל) לפתיחת טבעת האפוקסיד של BDDE ליצירת תרכובת 1,2-דיול.האיכות המונואיזוטופית של תרכובת זו שונה מזו של BDDE ולכן לא תושפע.LC-MS זיהה תזוזה מסה של 203.30/129.10 דא.
לבסוף, ניסויים אלה מראים שיצירת פסגות חדשות תלויה בנוכחות של BDDE, NAOH ובתהליך החיטוי, אך אין לו שום קשר ל-HA.
השיא החדש שנמצא בזמן שמירה של כ-2.71 דקות אופיינה אז ב-LC-MS.למטרה זו, BDDE (9.9 מ"ג/מ"ל) הודגרה בתמיסה מימית של 1% NaOH ונעשה באוטוקלאב.בטבלה 4, המאפיינים של השיא החדש מושווים לשיא הייחוס הידוע של BDDE (זמן שמירה כ-3.47 דקות).בהתבסס על ניתוח פיצול היונים של שני הפסגות, ניתן להסיק שהשיא עם זמן שמירה של 2.72 דקות מציג את אותם שברים כמו שיא ה-BDDE, אך בעוצמות שונות (איור 6).עבור השיא התואם לזמן השמירה (PIS) של 2.72 דקות, נצפה שיא עז יותר לאחר פיצול במסה של 147 דא.בריכוז ה-BDDE (9.9 מ"ג/מ"ל) בשימוש בקביעה זו, נצפו גם מצבי ספיגה שונים (UV, λ=200 ננומטר) בספקטרום האולטרה סגול לאחר הפרדה כרומטוגרפית (איור 7).השיא עם זמן שמירה של 2.71 דקות עדיין נראה ב-200 ננומטר, בעוד שלא ניתן לראות את שיא ה-BDDE בכרומטוגרמה באותם תנאים.
טבלה 4 תוצאות אפיון השיא החדש עם זמן שימור של כ-2.71 דקות ושיא ה-BDDE עם זמן שימור של 3.47 דקות
הערה: כדי להשיג תוצאות אלו, בוצעו ניתוחי LC-MS ו-HPLC (MRM ו-PIS) בשני הפסגות.לניתוח HPLC, נעשה שימוש בזיהוי UV באורך גל של 200 ננומטר.
ראשי תיבות: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HPLC, כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים;LC-MS, כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה;MRM, ניטור תגובה מרובה;m/z, יחס מסה למטען;PIS, סריקת יונים של מוצר;אור אולטרה סגול, אור אולטרה סגול.
הערה: שברי המסה מתקבלים על ידי ניתוח LC-MS (PIS).כרומטוגרמה עליונה: ספקטרום מסה של שברי מדגם סטנדרטי של BDDE.כרומטוגרמה תחתונה: ספקטרום המסה של השיא החדש שזוהה (RRT הקשור לשיא BDDE הוא 0.79).BDDE עבר עיבוד בתמיסת NaOH 1% ונעשה באוטוקלאב.
ראשי תיבות: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה;MRM, ניטור תגובה מרובה;PIS, סריקת יונים של המוצר;RRT, זמן שמירה יחסי.
איור 7 כרומטוגרמת יון של יון מבשר 203.30 Da, ו-(א) השיא החדש עם זמן שמירה של 2.71 דקות ו-(ב) זיהוי ה-UV של שיא הייחוס הסטנדרטי של BDDE ב-3.46 דקות ב-200 ננומטר.
בכל ההידרוג'לים HA המצולבים שנוצרו, נצפה שריכוז ה-BDDE השיורי לאחר כימות LC-MS היה <2 ppm, אך שיא חדש לא ידוע הופיע בניתוח.השיא החדש הזה אינו תואם את המוצר הסטנדרטי של BDDE.גם המוצר הסטנדרטי של BDDE עבר את אותה המרת איכות (המרת MRM 203.30/129.10 Da) במצב MRM חיובי.בדרך כלל, שיטות אנליטיות אחרות כגון כרומטוגרפיה משמשות כמבחני גבול לזיהוי BDDE בהידרוג'לים, אך מגבלת הגילוי המקסימלית (LOD) נמוכה מעט מ-2 ppm.מצד שני, עד כה, נעשה שימוש ב-NMR וב-MS כדי לאפיין את מידת ההצלבה ו/או השינוי של HA בשברי יחידת הסוכר של מוצרי HA המצולבים.מטרת הטכניקות הללו מעולם לא הייתה לכמת גילוי שאריות BDDE בריכוזים נמוכים כל כך כפי שמתארים במאמר זה (LOD של שיטת LC-MS שלנו = 10 ppb).
זמן פרסום: 01-01-2021